Was ist westliches Fleck-Protokoll?

Westliches Fleckprotokoll ist die genauen Standards, durch die der immunoblot Test durchgeführt wird. Westlicher Fleck wird benutzt, um Proteine in einer Gewebeprobe zu ermitteln. Der Prozess trennt gebürtige Proteine, indem er die Längen der Polypeptide using eine Gelelektrophorese feststellt. Die Proteine selbst werden dann auf eine Nitrozellulosemembrane gebracht und geprüft durch Antikörper.

Das erste Teil des westlichen Fleckprotokolls fängt mit Gewebeansammlung an. Diese Proben werden entweder von lebendem Gewebe oder von einer Zellkultur erfasst. Gewebe wird aufgegliedert und verschiedene Hemmnisse wie Protease oder Phosphatase werden eingeführt, um zu verhindern, dass Enzyme Verdauung durchführen. Dieser Teil des Protokolls wird normalerweise in den kalten Temperaturen behandelt, um die Gewebe zu konservieren.

Der Gelelektrophoreseprozeß ist der folgende Schritt im westlichen Fleckprotokoll. In diesem Teil werden die Proteine durch verschiedene Faktoren wie Molekulargewicht oder elektrische Gebühr gekennzeichnet. Dieser Prozess wird am allgemeinsten using Polyacrylamidgele mit einem Puffer des Natriumdodecylsulfats abgeschlossen. Im Allgemeinen werden die Proteine negativ - aufgeladen und in Richtung zu a positiv sich bewegen - belastete Elektrode innerhalb des Gels.

Übertragung der Proteine ist das folgende Teil des globalen westlichen Fleckprozesses. Eine Membrane wird auf das Gel gesetzt, gefolgt vom Filterpapier. Während ein elektrischer Strom ausgeübt wird, werden Proteine in die Membrane gezogen. Dieses gekennzeichnet als der tatsächliche “blotting† Teil der Analyse. Die Membranen sind und leicht empfindlilch gegen Schaden in hohem Grade zerbrechlich.

Der korrekte Fluss des westlichen Fleckprotokolls fordert den Schritt, der bekannt ist als binden. Um Verschmutzung der Proteine selbst durch die Antikörper zu verhindern die addiert werden müssen, muss eine Art der Abschirmung eingeführt werden. Die allgemeinste Art des Blockierens benutzt fettfreie trockene Milch und ein Reinigungsmittel. Dieses bindet an die geöffneten Punkte in der Membrane und lässt freiere Resultate zu, wenn der Antikörper addiert wird.

Abfragung ist der folgende Schritt entsprechend korrektem Protokoll. Die Proteine werden zu den Antikörpern eingeführt, die mit einem spezifischen Enzym verbunden worden sind, das Forschern die gewünschten Informationen gibt. Der Antikörper wird mit der Membrane für 30 Minuten oder mehr ausgebrütet. Danach wird die Membrane gewaschen und ein Sekundärantikörper wird eingeführt, der an den ersten bindet. Oftmals wird ein Lumineszenzmittel benutzt, um Wissenschaftler mit dem Kennzeichnungsprozeß zu unterstützen.

Das Material wird wieder gewaschen, um alle ungebundenen Einzelteile zu entfernen. Analyse der Größe der befleckten Bänder deckt Informationen betreffend den Vorsprung und Umfang eines spezifischen Proteins auf. Dieses wird im Allgemeinen einige Male, von der korrekten Analyse sicherzustellen abgeschlossen. Wahlen für Abfragung umfassen Röntgenstrahlen, Farbton und Chemikalien.